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HBS阳性者血清HBVDNA及序列分析
2011-04-18 来源:竞聘写作网 点击:

[摘要]研究套式代R在检测抗一HBs阳性不同模式者血清HBVDNA中的意义,从基因角度分析产生的原因。对麟例标本采用套式咒R检测HBVDNA并作序列分析,荧光定量法检测HBVDNA含量。抗一HBs阳性不同模式者常规代R法检测HBVDNA阳性率29.7%,套式PCR检测阳性率84.4%;套
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[摘要]研究套式代R在检测抗一HBs阳性不同模式者血清HBVDNA中的意义,从基因角度分析产生的原因。对麟例标本采用套式咒R检测HBVDNA并作序列分析,荧光定量法检测HBVDNA含量。抗一HBs阳性不同模式者常规代R法检测HBVDNA阳性率29.7%,套式PCR检测阳性率84.4%;套式PCR阳性组肝功能损害严重、HBVD-NA与IIBsAg值显著高于套式代R阴性组;套式PCR性阴/常规PcR阴性组48.6%的病例由于S基因变异导致IIB-巍肤氨基酸置换产生的,抗一HBs不能中和病毒而与HBvDNA共存。因此对那些抗一HBs阳性、肝功能反复异常者有必要进行套式代R检测,以提高HBv感染的诊断率。

HBVDNA是乙型肝炎病毒感染及复制最直接和可靠的标志。有报道单一抗一HBs阳性HBvDNA检出率n.8%,抗一HBs阳性、肝功能反复异常者血清和肝活检免疫组化证实39.7%系HBv感染[‘〕。我院对乙肝病毒血清标志物(HBVM)抗一HBs阳性不同模式者血清HBVDNA进行研究,发现套式PCR能显著提高抗一HBs阳性者血清HBVDNA的检出率,现将结果报告如下:

1材料与方法

1.1研究对象:64例均为1999年6月一2(XX)年12月我院门诊及住院的患者,男43例,女21例,年龄38.9士12.6岁,急性肝炎6例、慢性肝炎47例、慢性无症状携带者n例。诊断符合2(XX)年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的标准。1.2方法:1.2.IH丑VM以IN压系统检测,I呱全自动快速免疫发光分析仪及试剂由美国ABB01,11公司提供。1.2.2套式PCR检测HBVDNA及序列分析将100川血清用经典酚氯法常规提取HBVDNA作模板,加人P1、凡引物在扩增体系中扩增:94℃预变性3而n,男℃455,58℃455,72℃455循环25次,最后72℃5而n。产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,再加人P3、P4引物第二次扩增:94℃预变性2而n,94℃305,55℃305,72℃305,循环35次,最后72℃5而n,产物经琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察,513bP处存在荧光条带为阳性。鉴定后GIA甲ick纯化柱纯化。纯化产物及玛或P4引物加人测序试剂盒,置ABI310型DNA测序仪进行测序反应。HBV扩增引物由上海复旦遗传所提供,上海生物工程公司合成,S基因外侧正义引物P15’一代CCA于Cn刃陀以C-CTCrAA一3’,反义引物咒5’一CA卫劲LAGT-TACA〔:TCCrrCCT(;(;AC件一3’反义引物P45’一CCC-CAATACCACATCA代CA一3’,末段荧光标记测序试剂盒由美国Perkin一Ehaer(PE)公司提供;QIAqllick纯化柱为德国Giagen公司产品;GeneAlnl〕9。汉〕扩增仪和ABI310型DNA测序仪由PE公司生产。1.2.3定量PCR检测采用A川plisensorPCR测定J址清HBVI)NA拷贝数,按操作说明进行。试剂由美国BiotronicS公司提供。1.3统计学处理:采用S邢58.0进行两样本均数之间的比较,经方差齐性分析后,选择t或t’检验;构成比的差异性比较用护检验。

2结果

2.164例血清标本常规PCR检测HBVDNA阳性率29.7%(19/64),套式PCR法阳性率84.4%(54/研),护二39.1,p<0.01有显著性差异。2.2套式PC形常规PCR各组生化结果比较,其中白蛋白、球蛋白各组无显著性差异。2.4套式PCR(十)/常规PCR(一)组基因测序结果与基因库序列及无锡地区HBsAg、HBe雌、抗一HBc阳性急性肝炎患者S基因序列比较:17(48.6%)例出现了S基因第C14OA、C188G、T245G、贷肠G、竹68A厂巴72G、C30lG、A343T、A376G、T415G厂科以)G位核昔酸多位点的替换,导致HBsAg肤TH川Lnl币35、此ZA、1另gA、C9()S、L91A、H101A、THrll5S、1126A、C139G、5154A位氨基酸置换。

3讨论

本资料显示抗一HBs阳性不同模式中常规PCR比套式PCR对HBvDNA检测的阳性率为低,应该引起我们重视。套式PCR阳性组与套式PCR阴性组比较,前者肝功能损害较重、HBsAg(P/N)滴度高,HBvDNA含量高。提示套式PcR阳性组的患者体内有病毒复制和肝脏炎症反应。因此,对那些抗-HBs阳性肝功能反复异常,常规PCR阴性者有必要进行套式PCR检测以提高HBV感染的检出率。一般认为抗一HBs是HBsAg刺激机体后产生的保护性抗体,是HBV感染后出现免疫力的标志。我们的研究发现抗一HBS与HBVI)NA同时存在时,提示此时抗一HBS未能起到中和HBV的作用。VanNtlllenlzl报道慢性肝炎者抗一HBs对HBs纯的中和作用并不如预想的那么有效,因此需联合使用抗病毒药物接受乙肝疫苗后产生的抗一HBS有时能误导我们认为产生了免疫力,而实际上仍存在HBV的慢性感染图;在抗一HB,和HBVI)NA共存者中存在基因变异[4一7〕,导致抗一HB,几近丧失对HB人的中和作用。我们对套式代R阳性/常规PCR阴性血清HBVDNA基因测序结果同样发现:HBsAg“a’’决定簇及其两外侧端的氨基酸存在变异,导致抗一HBs不能中和病毒而与】mVDNA共存,病毒低水平复制。

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